LABTOX, CIBIOR-IMSS

Dr. JUAN M. GALLARDO MONTOYA
Laboratorio de Toxicologia
Centro de Investigacion Biomedica de Oriente -IMSS


PROTOCOLOS DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGIA Y BIOMEDICINA EXPERIMENTAL


DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES: METODO DE BRADFORD

METEODO:
Bradford - Espectrofotometría visible (595 nm)


FUNDAMENTO:

La prueba para determinar proteínas por el método de Bradford se basa en el acoplamiento del colorante con la proteína y se determina colorimetricamente, existe una relación directa entre el desarrollo del color y la concentración de proteínas. 

Con este método las proteínas tienen una capacidad de absorción máxima de 465 eso cambia a 595 nm cuando el colorante esta unido a las proteínas. Este es el principio básico del azul de Coomasie para la determinación de proteínas por Bradford (Shapiro. 1967) ahora se encuentra comercialmente por los laboratorios Bio-Rad, el método representado es una modificación de Bradford con los cambios sugeridos por Read and Northcote (Shapiro. 1967) la modificación ocasiona un incremento en la concentración del tinte, desarrollando una mayor sensibilidad y una marcada disminución en la variabilidad del color con diferentes proteínas lo cual es la principal desventaja del método.

La ventaja de este método es su simplicidad (solamente un reactivo) y su rapidez (5 min.) la tira del tinte es más sensitiva que la del Folin Fenol y no es afectada por reactivos comunes, se ha demostrado que algunas substancias pueden interferir con el desarrollo del color pero no hay evidencias de cambios sobre el color de las proteínas.

Componentes como la guanidina hidroclorada no tienen efecto sobre el reactivo blanco pero previene la formación de algún color de proteínas. Los detergentes y álcalis son los que interfieren en el ensayo en algunos casos esto puede ser corregido. El color máximo se desarrolla en cinco minutos pero el color puede disminuir de tono de 10 a 15 minutos en cuanto sea mayor la concentración de proteínas, la disminución máxima ocurre a las 4 h. Por todo lo anterior la valoración debe ser en un máximo de 10 hasta 15 min. el rango de error en el color es de un 2%.

No interfieren las formas cationicas ni los carbohidratos (sacarosa), sin embargo si es afectado por detergentes (dodecil sulfato de sodio, triton X-100, etc.), también interfieren las sustancias fuertemente alcalinas.


MUESTRA: Suero, Orina, Liquido cefelorraquideo, saliva, sudor, etc.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA: Refrigerar: 4 °C hasta por 72 horas. Congelar: -20 °C hasta por 2 meses.

OBSERVACIONES: Una vez obtenida la muestra, deberá centrifugarse (3000 r.p.m., 3 min.) a fin de separar las células u otro detritus celulares.


REACTIVOS

1. Albúmina sérica bovina (BSA)
2. Coomasie Brillante G-250
3. Etanol
4. Acido fosfórico


PROCEDIMIENTO

Para preparar 100 mL de Reactivo de Bradford 5X

1. Pesar 50 mg de Azul de Coomasie G-250 (Pierce)

2. Agregar 25 mL de Etanol (Baker), agitar continuamente (evitar la formación de grumos)

3. Añadir 50 mL de Acido fosfórico (Merk)

4. Agitar durante 60 min.

5. Aforar a 100 mL con agua desionizada

6. Conservar en frasco ámbar a 4 oC, esta solución es estable durante 6 meses.

7. Al momento de preparar el reactivo de Bradford IX filtrarlo.


MATERIAL Y EQUIOPO

•Espectrofotometro de placas
•Camara de 96 pozos
•Pipetas automaticas de 0-20 µL, 20-200 µL y 200-1000 µL


CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS: Conservar en frasco ámbar a 4 oC, esta solución es estable durante 6 meses.


PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA CURVA ESTANDAR Y DETERMINAR LA PROTEINA EN LAS MUESTRAS EXPERIMENTALES:

1. Diluya en reactivo de Bradford 5x 4:1 con agua desionizada y filtre en papel whatman del #1.

2. Consiga una cámara de 96 pozos (placa para ensayos de ELISA) de fondo plano.

3. Prepare los estándares (ver el cuadro mas abajo)

4. Coloque los estándares por triplicado. El cero o blanco corresponde a la primera fila.

5. Añada el volumen suficiente de agua desionizada hasta completar 100 µL

6. Pipetee 100 uL del reactivo de Bradford 1 X. 7.Incube por 5 minutos a temperatura ambiente.

8. Lea a 595 nm.

9. Grafique sus resultados (los ejes son comúnmente denominados como Y = A, 595 nm y X = µg/µL o mg/mL). Use la curva para determinar la concentración de proteínas en las muestras experimentales.


CURVA ESTANDAR

Preparar una solución patrón de Albúmina Serica Bovina (BSA, Sigma Chem.) 1 mg/mL, a partir de esta solución se tomaran las muestras para preparar los estándares de referencia, con ellos se construye la curva de referencia o curva estándar la cual tiene valores conocidos y con los que se comparara con las muestras experimentales para determinar en ella la concentración de proteína total. Use de preferencia la proteína que más se asemeje a lo que se desea medir (e.g. gamaglobulina, albúmina, etc.) Para BSA, use valores de 0 -50 µg como sus estándares para la curva de calibración. Para determinar la concentración de IgG, use 0-160 µg.

* Nota: La BSA no es muy buen estándar para este método, a pesar de ellos puede ser empleado sin problemas. Lisozyma u ovoalbumina y catalasa son mucho mejores.

Leer en espectrofotometro de placa a 595 nm


CURVA DE CALIBRACION

BSA (1 mg/mL) *Buffer o H2O desionizada **Reactivo de Bradford

Todo en µL (microlitros)

BSA 0 µL Agua * 100 µL Reac Brad ** 200 µL
2 * 98 ** 200
4 * 96 ** 200
8 * 92 ** 200
12 * 88 ** 200
16 * 84 ** 200
20 * 80 ** 200

Muestra experimental
5 * 95 ** 200
10 * 90 ** 200
20 * 80 ** 200




DR. JUAN M. GALLARDO.
Laboratorio de Toxicología, CIBIOR-IMSS.

Si tiene alguna duda, sugerencia y/o comentario es bienvenido
labtox@yahoo.com


Derechos reservados Dr. Juan M. GALLARDO
México, 1999.

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